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README.md

-# TP Next Generation Sequencing 2019
+# TP Next Generation Sequencing 2020
 
 Au cours de cette séance de TP nous allons chercher les mutations de-novo d'un enfant dont l'exome ainsi que celui de ses deux parents ont été séquencés par la technologie Illumina. Il vous faudra :
 
@@ -16,6 +16,43 @@ Certains outils ont besoin de place; le cas échéant, faites de la place, videz
 Le TP peut être long pour les débutants: concentrez vous sur la production du fichier VCF final, et cherchez à répondre aux questions de détails plus tard.
 
 
+## workflow
+
+![workflow.png](workflow.png "workflow")
+
+## Petit rappel sur la structure d'un Makefile
+
+> Les Makefiles sont des fichiers, généralement appelés **Makefile**, utilisés par le programme make pour exécuter un ensemble d'actions
+
+
+Un Makefile est un fichier constitué de plusieurs règles de la forme : 
+
+
+```
+cible1 : dependance1 dependance2 dependance3 dependanceN
+    commande1
+    commande2
+
+cible2 cible3 : dependance1 dependance2 dependance3 dependanceN
+    commande1
+    commande2
+
+cible4:
+    commande1
+    commande2
+
+```
+
+Chaque commande est prefixé par une tabulation.
+
+Lorsque l'ensemble des dépendances est analysé et si la cible ne correspond pas à un fichier existant ou si un fichier dépendance est plus récent que la régle, les différentes commandes sont exécutées. 
+
+Raccourcis:
+
+  * `$@` : nom de la cible courante
+  * `$^` : toutes les dependance
+  * `$<` : la premiere dependance
+
 ## Recupération des données FASTQ
 
 Les donnees sont telechargeable a l'URL suivante:
@@ -102,6 +139,9 @@ $ wget -O chrM.fa.gz "http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/chromosomes
 
 ```
 
+
+
+
 * Pour les autres, telechargez les séquences fa.gz  **chr22** et **chrM** de la version **hg19/GRCh37** du genome humain.
 
 ```
@@ -118,6 +158,9 @@ $ gunzip chr22.fa.gz chrM.fa.gz
 ```
 
 
+
+
+
 * Quelle est la taille du chromosome 22 ? Quelle est la taille du chrM ?
 
 ```
@@ -143,8 +186,20 @@ A l'aide de `cat`, concatenez ces deux fichiers dans un fichier que vous nommere
 $ cat chr22.fa  chrM.fa > ref.fa
 ```
 
+Par exemple dans un Makefile ça donnera:
 
-## TP septembre 2020
+```
+ref.fa: chr22.fa chrM.fa
+    cat $^ > $@
+
+chr22.fa chrM.fa:
+    wget -O $@.fa.gz "http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/$@.fa.gz"
+    gunzip $@.fa.gz
+
+```
+
+
+##  Mapper les Fastq sur le genome de reference
 
 A priori tous les outils ont été installés. Pas besoin d'installer samtools, bwa etc... comme décrit ci-dessous. En revanche vous devez indiquer au `bash` où se trouvent les outils en faisant:
 
@@ -468,8 +523,11 @@ Pour l'instant les reads ne sont pas triés sur la position génomique (chrom/st
 Usage: samtools sort [options...] [in.bam]
 Options:
   -l INT     Set compression level, from 0 (uncompressed) to 9 (best)
+  -u         Output uncompressed data (equivalent to -l 0)
   -m INT     Set maximum memory per thread; suffix K/M/G recognized [768M]
-  -n         Sort by read name
+  -M         Use minimiser for clustering unaligned/unplaced reads
+  -K INT     Kmer size to use for minimiser [20]
+  -n         Sort by read name (not compatible with samtools index command)
   -t TAG     Sort by value of TAG. Uses position as secondary index (or read name if -n is set)
   -o FILE    Write final output to FILE rather than standard output
   -T PREFIX  Write temporary files to PREFIX.nnnn.bam
@@ -488,6 +546,7 @@ Options:
                Number of additional threads to use [0]
       --verbosity INT
                Set level of verbosity
+
 ```
 
 
@@ -670,21 +729,23 @@ et créez le fichier **father.bam**
 
 Le calling des mutation se fait à l'aide de 
 
-* `samtools mpileup` qui va générer les bases trouvées à toutes les positions pour les 3 bams. Cet outil génére un fichier binaire de variants (BCF).
+* `bcftools mpileup` qui va générer les bases trouvées à toutes les positions pour les 3 bams. Cet outil génére un fichier binaire de variants (BCF).
 * `bcftools view` va transformer le **BCF** (binaire) en format *VCF* (*Variant Call Format*).
 
 ### Synopsis:
 
 ```
-$ samtools mpileup -g --output-tags DP --fasta-ref ref.fa --output mutations.bcf  file1.bam file2.bam ... fileN.bam 
+
+$ bcftools mpileup --output-type b --fasta-ref ref.fa --output mutations.bcf  -a 'INFO/AD'  -a 'FORMAT/DP'   file1.bam file2.bam ... fileN.bam 
 ```
 
-* `--output-tags DP` ajouter l'information du nombre de reads sous chaque mutation.
+* `-a FORMAT/DP` ajouter l'information du nombre de reads sous chaque mutation.
+* `-a FORMAT/AD` ajouter l'information du nombre de reads REF/ ALT sous chaque mutation.
 
 puis:
 
 ```
-$ bcftools call  --multiallelic-caller --variants-only --output-type z -o result.vcf.gz --format-fields GQ,GP mutations.bcf
+$ bcftools call  --ploidy GRCh37 -f GQ  --multiallelic-caller --variants-only --output-type z -o result.vcf.gz --format-fields GQ,GP mutations.bcf
 ```